وسترن بلات چیست؟
وسترن بلات یک روش متداول آنالیز پروتئین است و میتوان از آن برای تجزیه کیفی و نیمه کمی پروتئین ها استفاده کرد و در واقع پروتئین مورد نظر را از میان کمپلکس پروتئین ها جدا کرد. این تکنیک به صورت کلی شامل سه مرحله است:
- جدا سازی پروتئین ها بر اساس اندازه
- انتقال به یک غشای جامد
- علامت گذاری پروتئین ها با آنتی بادی اولیه و ثانویه برای تشخیص
روش انجام تکنیک وسترن بلات
اولین مرحله در وسترن بلات ، آماده سازی نمونه پروتئین به وسیله مخلوط کردن آن با دترجنتی[1] به نام سدیم دودسیل سولفات است که باعث می شود پروتئین ها به صورت زنجیره های خطی باز شوند و سپس دارای بار منفی شوند. در مرحله بعد با استفاده از روش الکتروفورز ژل، مولکول های پروتئین بر اساس اندازه از هم دیگر جدا می شوند. پس از جداسازی، پروتئین ها به یک غشای جامد منتقل می شوند. حال مرحله مسدود سازی یا بلاکینگ اتفاق می افتد که از بروز هرگونه واکنش غیر اختصاصی جلوگیری می کند.
در قدم بعدی غشا با آنتی بادی اولیه انکوبه[2] می شود و این آنتی بادی به پروتئین مورد نظر متصل می شود. سپس آنتی بادی هایی که اتصالی نداشتند، شست و شو داده می شوند تا حذف شوند. در مرحله بعد غشا دوباره با یک آنتی بادی انکوبه می شود اما این بار آنتی بادی کونژوگه به آنتی بادی اولیه متصل می شود و به آن آنتی بادی ثانویه می گویند. این آنتی بادی ثانویه به یک آنزیم خاص متصل است که باعث تولید رنگ یا نور می شود تا بدین وسیله، تشخیص پروتئین میسر شود.
کاربردهای وسترن بلات
وسترن بلات هم در تحقیقات زیست شناسی و پزشکی و هم در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی کاربرد های فراوانی دارد.
- کاربرد در تشخیص پزشکی : در دهه های اخیر وسترن بلات کاربرد وسیعی در تست های تشخیصی بیماری های مختلف داشته است. مانند HIV ، BSE [3]، FIV [4] و HBV [5]. معمولا وسترن بلات به عنوان یک تست تائیدی برای این بیماری ها به کار می رود. مثلا وقتی نتایج تست الایزا مثبت باشد این تست برای تائید نتیجه آن به کار می رود.
- وسترن بلات یک روش عالی با حساسیت بالا به منظور شناسایی یک پروتئین خاص حتی در مقادیر کم می باشد.
- تشخیص اصلاحات و تغییرات پس از ترجمه پروتئین
- تشخیص بر همکنش های پروتئین ـ پروتئین و پروتئین ـ DNA
- از این تکنیک برای تعیین کمیت پروتئین ها و سایر محصولات ژن در مطالعات بیان ژن، استفاده می شود.
- از آنجایی که وسترن بلات پروتئین ها را بر اساس اندازه و توانایی اتصال به آنتی بادی تشخیص می دهد، برای ارزیابی بیان پروتئین در سلول ها و تجزیه و تحلیل فراکسیون های پروتئینی طی خالص سازی پروتئین مناسب است.
- وسترن بلات همچنین برای تجزیه و تحلیل بیومارکر های مختلف مانند فاکتورهای رشد، سایتوکاین ها و هورمون ها استفاده می شود.
مزایای وسترن بلات
- حساسیت بالا : یکی از مهم ترین مزایای وسترن بلات ، توانایی آن برای تشخیص حتی یک دهم نانوگرم از یک پروتئین خاص در یک نمونه است به طوری که این تکنیک می تواند به عنوان یک ابزار تشخیصی اولیه که کوچکترین پاسخ ایمونولوژیک از سوی ویروس یا باکتری را در نمونه بیمار تشخیص می دهد، موثر باشد.
- اختصاصی بودن : وسترن بلات این خصوصیت خود را مدیون دو عامل مهم است : اولی الکتروفورز ژل است که نمونه را به پروتئین هایی با اندازه، بار و ترکیب متفاوت دسته بندی می کند. این فرایند به خودی خود گام بزرگی به سوی تشخیص است زیرا نوار های تشکیل شده در ژل، از قبل سرنخ هایی در مورد اندازه پروتئین یا پلی پپتید مورد نظر به ما می دهد. تعامل آنتی بادی ـ آنتی ژن به عنوان دومین عامل در اختصاصیت وسترن بلات می باشد. از آنجایی که آنتی بادی های خاص به پروتئین های خاص تمایل دارند، این فرایند می تواند به طور انتخابی یک پروتئین هدف را حتی در مخلوطی از ۳۰۰۰۰۰ پروتئین شناسایی کند .
معایب ، چالش ها و محدودیت های وسترن بلات
- مستعد نتایج نادرست : علی رغم حساسیت بالا و اختصاصی بودن این تست ، وسترن بلات همچنان می تواند نتایج اشتباه ایجاد کند. مثلا هنگامی که یک آنتی بادی با یک پروتئین غیر اختصاصی خود واکنش می دهد، نتیجه می تواند مثبت کاذب شود که این اتفاق در آزمایش فرد مبتلا به HIV که به عفونت های دیگری مانند سل هم مبتلا است، بسیار دیده می شود. از سوی دیگر اگر زمان کافی به پروتئین های بزرگ تر برای انتقال به غشا داده نشود، به راحتی می تواند منجر به یک نتیجه منفی کاذب شود. بلاتینگ[6] و پردازش نامناسب هم می تواند باعث ایجاد نوار های کج ، محو یا حتی چندگانه شود که آزمایش را نیازمند تفسیر دقیق توسط تکنسین می کند.
- هزینه بالا : هزینه های وسترن بلات ترکیبی از هزینه های جدا برای آنتی بادی های دارای لیبل، تحلیلگران ماهر و تجهیزات ازمایشگاهی است. وسترن بلات یک فرایند حساس است که نیازمند دقت در هر مرحله برای شناسایی اجزای تشکیل دهنده نمونه است. یک خطای جزئی در هر یک از مراحل آن می تواند برای کل فرایند فاجعه بار باشد. در نهایت تجهیزات مورد نیاز برای تشخیص و تصویربرداری کمیلومینست[7] ، فلورسنت ، رادیواکتیو یا سیستم های تشخیص لیزری می تواند برای یک واحد میکروبیولوژی متوسط بسیار گران باشد.
[1] detergent [2] incubation [3] Bovine Spongiform Encephalopathy ( جنون گاوی) [4] Feline Immunodeficiency Virus [5] Hepatitis B Virus [6] blotting [7] chemiluminescent
منابع
- https://www.nature.com/scitable/definition/western-blot-288/
- https://sciencing.com/disadvantages-western-blotting-8379318.html
- https://microbenotes.com/western-blot/
- https://www.creative-proteomics.com/blog/index.php/the-principle-and-procedure-of-western-blot/
جمع آوری و تولید محتوا: لاله دهقانی
